Методы определения КФК-MB

Все, кто хоть сколько-нибудь занимался клинической биохимией, наверняка, сталкивались с ситуацией, когда при измерении КФК-MB ее активность оказывается выше, чем общая активность КФК. Как такое может быть!? И самое главное, что в таких случаях делать!?

Что такое КФК

КФК - креатинфосфокиназа или просто креатинкиназа это фермент, катализирующий реакцию обратимого фосфорилирования креатина с помощью АТФ. Фермент представляет из себя димер состоящий из двух субъединиц. Субъединицы бывают типа M и типа B. Соответственно соединяясь между собой в димер они образуют три различных варианта фермента MB, MM и BB соответственно. Данные изоформы до некоторой степени обладают тканевой специфичностью. Так например изоформа BB встречается преимущественно в нервной ткани, простатической железе, кишечнике и легких. Форма MM присутствует главным образом в мышечной ткани. Форма MB так же присутствует как в скелетной, так и в сердечной мускулатуре, но ее активность в скелетных мышцах (<5%) значительно ниже, чем в сердце (25-46% от общей активности КФК).

Соответственно на определении в сыворотки крови активности КФК-MB основан один из самых ранних лабораторных тестов для диагностики повреждения сердечной мышцы.

Методы определения КФК-MB

Существует несколько методов определения КФК-MB. Перечислим три из них:

  • электрофорез - наиболее точный в настоящее время метод, позволяющий разделить фермент на все изоформы, а также имеющий возможность выделять макроформы КФК и митохондриальные фракции данного фермента
  • ионообменная хроматография
  • иммунологические методы, в том числе самый быстрый и дешевый метод биохимического определения активности КФК-MB с иммуноингибированием, широко применяемый во всех диагностических лабораториях, а также широко известный своей тенденцией к завышению значений, о нем в основном и пойдет речь в данной статье

Биохимические методы определения ферментов

Простейшая модель определения активности фермента биохимическим методом выглядит так: в одной пробирке смешиваются фермент (в нашем случае сыворотка крови пациента) и субстрат для этого фермента (биохимический реагент). При этом необходимым условием является то, чтобы сам субстрат для фермента или продукт реакции должен быть окрашенными веществами (обладали оптической плотностью).*

При этом после смешивания начинает протекать биохимическая реакция, фермент начинает перерабатывать свой субстрат в продукт реакции и по скорости изменения оптической плотности мы можем сделать вывод о скорости протекания реакции, а следовательно и о концентрации фермента.

Нужно сделать небольшую оговорку о том, что при измерении содержания ферментов биохимическими методами речь идет именно об измерении активности фермента, а не о его абсолютном содержании в пробе (концентрацию измерить не удастся). И если фермент по какой-либо причине присутствует в пробе, но не катализирует соответствующую ему реакцию, то мы будем говорить, что активность фермента в пробе нулевая (при этом истинное содержание фермента нам не известно).

КФК в этом плане не является исключением. Для определения ее активности смешивают сыворотку крови пациента (содержащую КФК) с реагентом для ее определения (содержащим креатинфосфат и АДФ). При этом в димерном ферменте каждая из субъединиц обладает собственной каталитической активностью, то есть каждый фермент несет на себе два активных центра на одной и на второй субъединице.

Селективное определение активности КФК-MB

Определение активности КФК-MB биохимическими методами основано на предположении, что в крови отсутствует изоформа КФК-BB. При этом измерение проводится точно по такому же принципу, как и в случае с определением общей активности КФК, за исключением того, что к реакционной смеси добавляются еще антитела, которые блокируют активность M-субъединиц фермента (в этом и заключается иммуноингибирование). После добавления блокирующих антител проводится измерение активности КФК, которая уже обусловлена только наличием B-субъединиц фермента. А так как мы предполагаем, что изоформа КФК-BB полностью отсутствует, то каждая B субъединица представляет из себя половину КФК-MB изоформы фермента оставшегося после инактивации M субъеденицы (все КФК-MM изоформы инактивируются полностью). Следовательно, чтобы получить полную активность КФК-MB нужно получившуюся при измерении активность B субъединиц умножить на два.

Недостатки метода

Как видно из объяснения выше данный метод является косвенным, со всеми вытекающими из этого недостатками. Зачастую при определении активности КФК-MB результат получается выше, чем активность общей КФК. Учитывая перечисленное, даже когда результат по КФК-MB теоретически согласуется с результатом общей активности КФК (то есть не превышает её) всегда остается вопрос насколько данное значение близко к истинному или насколько оно его превышает. Существует несколько объяснений ложного завышения значений КФК-MB при измерении методом иммуноингибирования, приведем два самых распространенных:

Наличие в крови BB фракции

Самой очевидной причиной завышения значений КФК-MB является то, что наше предположение относительно отсутствия у пациента BB фракции фермента не оправдалось. Данное состояние, очевидно должно встречаться при поражении тканей, содержащих данную изоформу фермента.

Нетрудно подсчитать, что если весь содержащийся в сыворотки крови фермент будет представлен КФК-BB фракцией, то при измерении методом иммуноингибирования мы получим активность КФК-MB в два раза выше, чем общей КФК, так как блокирующие антитела не работают и мы просто будем умножать активность КФК на два.

Наличие макроформ КФК

Помимо очевидно варианта с ложностью предположения об отсутствии КФК-BB фракции существует еще вариант с завышением активности КФК-MB за счет присутствия макроформ КФК (по литературным данным 2-6 % пациентов).

Макроформы КФК бывают двух типов:

  • тип 1 - это комплексы фермента с иммуноглобулинами классов G или A
  • тип 2 - это олигомерные комплексы митохондриальных фракций фермента (да, есть еще и такие)

В качестве примера рассмотрим, как макроформы первого типа могут влиять на нашу реакцию иммуноингибирования.

В качестве основной причины завышения КФК-MB в данной ситуации на сегодняшний день выдвигается следующее объяснение:

Аутоантитела присоединяются к M субъединице фермента. При этом эпитопом служит не активный центр фермента и блокировки ферментативной активности не происходит. В то же время эпитоп для аутоантител расположен достаточно близко от активного центра фермента чтобы помешать связыванию с ферментом блокирующих антител. Эпитопом для блокирующих антител является непосредственно сам активный центр фермента.

Получается ситуация, когда при добавлении блокирующих антител блокировка не происходит по причине того, что к M субъединице уже присоединены аутоантитела.


Конечно, ситуацию, когда у пациента весь имеющийся фермент представлен изоформой КФК-BB или макроформами представить трудно, но тем не менее встречаются ситуации, когда данные изоформы фермента присутствуют в количестве достаточном, чтобы повлиять на принятие диагностического решения и соответственно на прогноз и стратегию лечения.

Что делать

Как уже было сказано выше метод определения активности КФК-MB с иммуноингибированием исторически является одним из самых ранних методов лабораторной диагностики повреждений миокарда.

Он безусловно был прорывом в лабораторной диагностике в свое время. Но много воды утекло с тех пор и в настоящее время столь широкое распространение данного метода можно объяснить только экономическими аспектами (то есть недостаточным финансированием).

Как вариант, возможно использование более дорогих и точных методов определения КФК-MB. И хотя использование электрофореза не совсем оправданная альтернатива в клинической лабораторной диагностике, то переход с биохимического метода на определение КФК-MB "по массе" то есть иммуноферментными методами кажется наиболее предпочтительной альтернативой.


* Реализация данного принципа может быть осуществлена через ряд дополнительных реакций.

06.06.2018