Фотометрия в лабораторной диагностике

Фотометрия - это широко используемый метод в лабораторной диагностике. Большинство показателей исследуемых в разделе "биохимия" измеряется при помощи фотометрии. Помимо биохимии фотометрия используется в ИФА, общем анализе мочи и крови и т.д.

В дальнейшем, для простоты в статье будет рассматриваться только горизонтальная фотометрия в проходящем свете (то есть измерение оптической плотности растворов).

Итак, все начинается с простейшей схемы прибора, который используется для фотометрической детекции.

В простейшем случае световой поток от источника света налетает на исследуемый раствор. После прохождения через раствор ослабленный световой поток попадает на фотодетектор. Поскольку условия, при которых проводится измерение подбираются так, что вся оптическая плотность раствора обусловлена присутствием одного вещества, то измеряя оптическую плотность мы можем, в конечном итоге, определять концентрацию этого вещества.

Физические основы фотометрии

Физический принцип, лежащий в основе данного процесса, называется законом Бугера-Ламберта-Берра.

Где:

• I - интенсивность света прошедшего через раствор
• I₀ - исходная интенсивность падающего на кювету с раствором света (ее можно измерить, просто убрав кювету с раствором так, чтобы свет от источника непосредственно падал на фотодетектор)
• c - концентрация поглощающего вещества в растворе (ммоль/л)
• l - толщина поглощающего слоя (см)
• e_λ - молярный коэффициент поглощения (л×моль^-1×см^-1) величина индивидуальная для каждого вещества при определенной длине волны

Таким образом, если принять, что в условиях измерения которые мы можем стандартизировать величина e_λ известна, толщина поглощающего слоя известна и вообще то определяется нами, величины I и I₀ выясняются в процессе измерения, следовательно зная все эти показатели в конечном счете можно вычислить концентрацию исследуемого вещества.

Прологарифмировав нашу исходную формулу по основанию 10, получим:

Далее путем нехитрых преобразований получаем:

Величина lg I₀/I называется оптической плотностью и как правило обозначается буквами A или D или OD. Поскольку величины e_λ и l являются постоянными при каждом измерении, то оптическая плотность линейно зависит только от концентрации измеряемого вещества в растворе, следовательно измеряя оптическую плотность мы можем определить концентрацию.

Проведение калибровки

Как уже было сказано выше оптическая плотность и концентрация определяемого вещества связаны линейной зависимостью.

Отсюда следует, что, зная уравнение прямой для данной зависимости мы можем по любой известной оптической плотности узнать концентрацию интересующего нас вещества.

Для того, чтобы узнать это уравнения проводится процедура калибровки.

На практике если калибровка делается вручную процедура заключается в построении так называемой калибровочной кривой (которая в случае фотометрического измерения чаще всего является прямой линией :).

Для построения линейной зависимости требуется как минимум две точки.

Для начала берется раствор с известной концентрацией вещества (калибратор), которое мы собираемся измерять. После проведения соответствующей химической реакции измеряется оптическая плотность получившейся реакционной смеси, при этом на графике по оси абсцисс откладывается концентрация вещества в растворе, а по оси ординат получившаяся оптическая плотность. Таким образом мы получаем первую точку на графике. Для получения второй точки можно использовать раствор с другой концентрацией, но на практике исходят из предположения, что раствор с нулевой концентрацией обладает нулевой оптической плотностью и в качестве второй точки просто берется начало координат (на самом деле это не так, но это преодолевается при помощи специальных процедур настройки прибора), что позволяет проводить калибровку большинства показателей биохимии по калибратору только с одним уровнем концентрации.

Таким образом получается график, используя который, можно по известной оптической плотности определить концентрацию вещества в растворе.

В современный лабораториях калибровку как правило вручную не проводят, это делается автоматически биохимическими анализаторами или другими приборами с фотометрической детекцией на борту.

Суть остается той же за исключением того, что прибор делает расчет для нахождения функции, описывающей калибровочный график, и далее использует ее для расчета концентраций. Калибровочный график при этом строится исключительно для удобства пользователя.

В общем виде функция, описывающая прямую линию, выглядит следующим образом:

Где:

• y - оптическая плотность
• x - концентрация исследуемого вещества
• a - тангенс угла наклона нашей прямой (фактор калибровки)
• b - оптическая плотность при нулевой концентрации, как правило равна нулю

Поскольку значение b при помощи настроек прибора приводится к значению ноль, то вся процедура калибровки сводится к нахождению фактора калибровки, при умножении на него оптической плотности анализатор в дальнейшем вычисляет все концентрации интересующего нас вещества.

Выбор длинны волны

При проведении фотометрического измерения источник света как правило генерирует световой поток по всему видимому (и не только) спектру длин волн. Источники света современных биохимических анализаторов как правило охватывают диапазон от ближнего ультрафиолета и до всего видимого красного диапазона.

Как уже говорилось ранее молярный коэффициент поглощения является функцией от длинны волны и следовательно исследуемый раствор будет обладать разными коэффициентами поглощения на разных длинах волн. При этом на практике, в основном для того, чтобы избежать влияния неспецифических факторов, измерения проводится на какой-то одной определенной длине волны.

Для выбора длины волны на заре лабораторной диагностики существовало такое наивное эмпирическое правило: если мы видим, что раствор окрашен в какой-либо цвет, то нужно выбрать для измерения длину волны по цвету, отличающуюся от цвета раствора.

Помимо того, что данный подход слишком упрощен, он еще и не применим к ультрафиолетовой части спектра.

Более научный подход заключается в построении графика зависимости оптической плотности раствора от длинны волны.

Поскольку измеряемые биохимическими методами биологические вещества, как правило не обладают достаточной собственной оптической плотностью, для их детекции используются различные специфические химические реакции, которые в итоге и генерируют вещества обладающие достаточной оптической плотностью, в этом случае говорят, что реакция идет с увеличением оптической плотности. Либо в процессе реакции такие вещества расходуются, тогда реакция идет с уменьшением оптической плотности.

Для выбора длинны волны для конкретного метода проводится построение двух графиков зависимости оптической плотности раствора от длинны волны:

• для субстрата (субстратов) химической реакции
• и для продуктов (продукта) химической реакции

После построения графика берется длинна волны, на которой разность оптической плотности у субстратов и продуктов реакции максимальна.

Для примера можно взять так называемый оптический тест Варбурга.

Данная реакция широко используется как индикаторная многими производителями для определения ЛДГ, АЛТ, АСТ, КФК, КФК-МБ, мочевины и глюкозы (гексокиназным методом).

Данная реакция заключается в обратимом окислении никотинамидадениндинуклеотида (НАД) под действием какого-нибудь фермента из класса оксидоредуктаз.

В результате мы имеем два графика для окисленной и восстановленной формы НАД одна из которых играет роль субстрата, а другая продукта реакции в конкретных биохимических наборах.

В результате анализа данного графика видим, что наибольшая разница оптической плотности между этими двумя формами находится в районе 340 нм. Именно эта длинна волны и используется для определения перечисленных выше биохимических показателей.

Устройство, которое преобразует свет от источника в световой поток с какой-то одной определенной длинной волны называется монохроматор.

Основные типы монохроматоров:

• Абсорбционный светофильтр - самый первый монохроматор, по большому счету представляющий из себя просто цветное стеклышко
• Дифракционный светофильтр
• Призма
• Дифракционная решетка - в настоящее время у большинства лучших биохимических анализаторов монохроматор представляет из себя голографическую дифракционную решетку

Таким образом, если включить в нашу схему простейшего фотометра монохроматор (например призму), то она будет выглядеть следующим образом.

Бихроматическое измерение

В лабораторной диагностике зачастую возникают ситуации, когда нужно провести измерение оптической плотности на двух длинах волн. Такие измерения называются бихроматическими.

Теоретическое обоснование проведения такого измерения следующее: в биологических жидкостях присутствует огромное количество различных веществ, некоторые из которых могут обладать собственной оптической плотностью или вступать в неспецифические реакции с компонентами диагностический наборов, при этом зачастую биологические жидкости могут проявлять свойства коллоидных растворов и не только поглощать, но и рассеивать свет. Поэтому для того, чтобы учесть влияние этих интерферирующих факторов оптическая плотность рассчитывается как разность между оптической плотностью на основной длине волны (о ней уже шла речь выше) и другой длине волны, которая обычно называется опорной или отсекающей, оптическая плотность на которой, как считается, обусловлена неспецифическими факторами.

Приведенная в предыдущем разделе конструктивная схема фотометра называется монохроматической. Исторически она возникла первой, но в современных машинах практически не используется.

Монохроматической она называется потому, что в каждый конкретный момент времени считывание оптической плотности проводится только на одной длине волны и для того, чтобы провести бихроматическое измерение нужно, например, физически поменять светофильтр или изменить угол поворота призмы или дифракционной решетки. В некоторых вариантах проведения фотометрии это неприемлемо (например, кинетические измерения). Поэтому в дальнейшем была разработана полихроматическая схема детекции, которая позволяет считывать оптическую плотность раствора на нескольких длинах волн. Этого было достигнуто разложением полихроматического света в спектр уже после прохождения через поглощающий раствор (то есть перенесением монохроматора за кювету с образцом) и установкой сразу нескольких фотодетекторов для разных длин волн.

Такая схема позволяет проводить измерение на нескольких длинах волн одновременно.

Методы расчета концентрации

Существует несколько способов расчета концентрации раствора по полученной оптической плотности.

Наиболее простым является метод расчета по конечной точке.

При таком методе график зависимости оптической плотности от концентрации измеряемого вещества выглядит следующим образом:

При этом после небольшого времени задержки (lag-time), связанного с перемешиванием биоматериала с компонентами диагностического набора и их термостатированием происходит резкое возрастание оптической плотности до определенного уровня, пропорционального концентрации определяемого вещества, после выхода оптической плотности на "плато" дальше она уже практически не изменяется (достигает конечной точки).

Данный метод не пригоден для измерения активности ферментов, а биохимическими методами измеряется именно активность ферментов, а не их концентрация.

Для измерения активности ферментов используется кинетический метод расчета концентрации график которого выглядит примерно так:

После некоторого времени задержки, обусловленного теми же факторами, происходит непрерывное изменение оптической плотности (на графике нарастание) с постоянной скоростью, которая и определяет активность фермента. При этом скорость реакции определяется как тангенс угла наклона графика изменения оптической плотности. Чем круче изменяется оптическая плотность, тем больше активность фермента.

Данные два метода являются основными.

Помимо них так же еще существует турбидиметрический метод измерения, при помощи которого измеряются высокомолекулярные вещества, обладающие антигенной природой, но данный метод уже основан на других физических принципах и к фотометрии не относится.

29.07.2019